His标签蛋白纯化介质（IDA系列）

包括以下产品:

HP-IDA / HP-IDA-120 / CP-IDA / GP-IDA

1、产品简介

       His标签融合蛋白纯化通常采用固定化金属离子亲和层析（IMAC）纯化的方法，主要利用介质配基首先螯合的金属离子，再吸附表面带组氨酸标签的蛋白。由于重组蛋白分子上的His标签可与螯合的金属离子（如 Ni²⁺、Co²⁺、Cu²⁺等）发生亲和吸附，通过调节溶液中洗脱剂浓度，实现重装蛋白的吸附与解吸附，从而达到分离纯化蛋白的目的。博进生物的His标签蛋白纯化介质IDA系列专为His标签融合蛋白的纯化而设计，以具有刚性结构的聚丙烯酸酯微球作为基质，采用亚氨基二乙酸（IDA）为金属螯合配基，标准备货螯合Ni²⁺（常称为镍介质）适用于His标签蛋白的快速高效提取，且具有较大通量的特点，可快速从细胞破碎液/培养液中捕获His标签融合蛋白，尤其适用于粘稠料液。

       请注意，选择该产品时切勿在缓冲液中添加巯基乙醇或二硫苏糖醇等还原剂，将导致金属离子脱落（如需要添加还原剂组分，建议选择博进生物的NTA产品）。

2、产品特性

3、使用方法 

       His标签蛋白纯化-IDA介质系列层析操作通常包括平衡、上样、淋洗、洗脱、再生等步骤。

具体的操作方法如下：

3.1平衡：

     用5~10CV的平衡缓冲液平衡层析柱，至流出液电导和pH不变（与平衡液一致）。实际操作中，一般选用中性/弱碱性（pH 7~8）的高盐（0.15~1.0 M NaCl或其它中性盐）缓冲液。其中常用磷酸盐缓冲体系，如20 mM PB+0.5 M NaCl, pH 7.4。对于结合力较强的带组氨酸标记的蛋白质，平衡缓冲液中可加入低浓度（20~40 mM）的咪唑。

3.2上样：

     样品缓冲液应尽可能与平衡液一致。固体样品可用平衡液溶解配制；低浓度样品溶液可用平衡液透析；高浓度样品溶液可用平衡液稀释。为了避免堵塞层析柱，样品应经离心或微滤处理。进料量根据介质的载量和料液中目标蛋白的含量计算。为了减少杂蛋白在层析柱上的吸附，可在确保目标蛋白吸附的情况下适当增加样品缓冲液中的咪唑。对于包涵体蛋白，相应地可在平衡、上样和洗脱的缓冲液中加入8M 尿素或6M 盐酸胍。

3.3淋洗：

     上样结束后继续用平衡缓冲液淋洗，直至紫外下降至基线。

3.4洗脱：

     洗脱一般有两种方式，一是采用竞争试剂，如咪唑（0~0.5M）、组氨酸（0~0.05M）、氯化铵（0~2M）等将蛋白质从柱子上置换下来；二是减小pH值，洗脱目标蛋白，大多数蛋白质在pH 4~6的范围内可被洗下来。用竞争试剂咪唑或减小pH值的方法洗脱蛋白质，金属离子仍结合在柱子上；若用竞争试剂组氨酸或氯化铵洗脱蛋白质，会将金属离子和蛋白质的复合物一起洗下来。

洗脱缓冲液中必须加入0.15~1.0 M NaCl以消除离子交换作用。梯度洗脱最好在起始平衡液的恒定pH下进行，可采用线性梯度或阶越式梯度洗脱。

3.5再生：

     介质使用多次后（具体与发酵液样品及杂质特性等有关），或者螯合其它金属离子前，需要进行再生处理。

脱Ni：用5倍体积的EDTA溶液（0.2M EDTA+0.5M NaCl, pH 7.0）以低流速（建议正常上样流速的1/2）清洗介质，然后用5倍体积的0.5M NaCl清洗以去除残留的EDTA。

清洗：可用2~3倍体积以上的2M NaCl清洗，除去以离子键结合的蛋白，再用3倍体积以上的纯水冲洗。

可用5倍体积的0.5-1M NaOH（或2M NaCl溶液）清洗介质，除去色素或者其他强吸附蛋白，然后用0.2M PBS缓冲液平衡冲洗5-10倍体积（有条件的情况下可通过pH检测溶液pH值变化，pH洗至缓冲液的pH值即可）。

可用5~10倍体积的70%乙醇或30%异丙醇清洗（20 min 以上），并用3~10倍体积的纯水冲洗。请注意，异丙醇不易清洗干净，建议加大冲洗体积。

此外，也可用2倍体积含去污剂的碱性或酸性溶液清洗。如用0.1~0.5%的非离子去污剂+0.1M乙酸冲洗1~2h，并用5~10倍体积的70%乙醇冲洗去除去污剂，然后用3~10倍体积的纯水冲洗。

挂Ni：采用3-5倍体积的0.1M NiSO₄溶液与介质混合搅拌4h，然后过滤。（亦可柱上操作，用3-5倍柱体积的0.1M NiSO₄溶液低流速上柱，为确保挂Ni充分，可采用NiSO₄溶液循环的方式上柱三次）。

 平衡：用3倍体积的去离子水清洗介质，再用5-10倍体积含0.25M咪唑+0.5M NaCl溶液冲洗，去除残留的Ni²⁺，最后用5倍体积去离子水清洗介质即可。

3.6保存：

     采用2-5倍体积的20%乙醇清洗介质，结束后储存于2-30℃环境中。

3.7其它注意事项：

     在使用和保存柱子的时候，要避免柱子流干或密封不严，防止气泡进入。

4.4、订购信息